核酸定量哪家强?Nanodrop vs. Qubit - 知乎

来自 : 发布时间：2024-05-20

核酸定量哪家强？Nanodrop vs. Qubit - 知乎写文章核酸定量哪家强？Nanodrop vs. Qubit吴思涵​生物学话题下的优秀答主184 人赞同了该文章开头先做一点重要声明：不是软文不是软文不是软文必须说三遍！本文仅是个人使用心得，不涉及任何商业利益，没收过半毛钱。而且基于紫外吸收和荧光染料的两台代表性仪器目前都同属于一家厂商旗下，所以不用撕。以下开始正文。凡是需要做分子生物学实验的lab，肯定逃不了要买一台核酸定量的机器。目前最为流行的仪器是Nanodrop，只需滴加一两微升的样品，按一下按钮，利用核酸的紫外吸收特性，即可得到浓度数据。近几年，以Qubit为代表的基于特异荧光染料法的仪器也逐渐进入科研人员的视野。那么，这两类仪器有什么区别，在使用时需要注意什么，如何根据实验室需求来选购？且听老司机分解。（注：以安捷伦公司为代表的毛细管电泳法不在本文的讨论范围内。）首先我们需要来理解两台仪器在核酸定量原理上的区别。正如方才所言，Nanodrop利用了核酸的紫外吸收特性。（图1：Nanodrop全家福）核酸，包括DNA和RNA，均由核糖、磷酸基以及碱基构成。其中，由于碱基含有芳香环结构，因此具有紫外吸收的特性。核酸的特征吸收波长为260 nm。根据朗伯比尔定律，已知物质的消光系数（几十年前早已测量），液层的厚度（固定的样品室），就能利用其吸光度来计算出物质的浓度。与此同时，还能通过计算A260/A280和A260/A230的数值，估计核酸的纯度。（280 nm吸光通常来自蛋白质，而230 nm则通常来自糖类和苯酚等。）而Qubit这一类仪器采用的是荧光染料法。这些荧光染料可以特异地与不同种类的核酸链相结合，并在特定波长光源的激发下，发出荧光。其中，结合了核酸的荧光染料，相比那些游离的，信号可增幅数十倍至数百倍，因此可以和背景区分开来。目前，做测序的实验室基本把Qubit当标配仪器了。（图2：Qubit 3.0及配套试剂）虽然以Nanodrop为代表的紫外吸收法在科研领域已经沿用了数十年，但由于原理上的限制，这一类仪器有无法避免的缺陷。1、紫外吸收法无法区分DNA和RNA这一点其实在原理上就很好理解了。如下图所示，具有紫外吸收的结构是核酸的碱基，而DNA和RNA均含有碱基，因此当一份样品同时含有DNA和RNA的时候，无论你本意是想测哪一个，均会高估其真实浓度。（图3：核酸的结构）而Qubit的荧光染料法则避免了这个问题。只要采用DNA、RNA特异的染料，就能有选择性地测定样品中的核酸浓度。下图是Qubit的官方测试数据。这个实验是在DNA样品中混合入不同比例的RNA，并用Qubit法和紫外吸收法分别进行测定。当DNA的样品足够纯时（DNA：RNA = 10：0），两种方法测得的数值并没有显著区别。但当混入的RNA越来越多，紫外吸收的数值也跟着升高（蓝色和绿色柱子），而使用双链DNA染料的Qubit数值则没有改变（红色柱子）。使用RNA染料用Qubit进行测定，则会发现，随着RNA混入的增加，读数也跟着升高。（图4：Qubit和紫外吸收法对DNA-RNA混合样品的测定）目前，双链和单链DNA、RNA及蛋白质均有特异的荧光染料。也就是说，无需专门纯化样品，或者在未知污染程度的情况下，使用Qubit可以方便地得知浓度信息。2、紫外吸收法的定量限较高记得有一次做实验，放了0.5 µg质粒做酶切，跑胶回收于30µl的溶液中，然后做Nanodrop测定浓度，最后数值约为25ng/µl……